Знание структуры и функции генов, основных видов изменчивости, знакомство с наследственными болезнями позволяет перейти к анализу молекулярно-генетических методов. Методы молекулярной генетики направлены на изучение молекулы ДНК как в норме, так и при ее повреждении, а также на «манипуляции» с молекулами ДНК и РНК. Использование молекулярно-генетических методов требует знания основных этапов получения определенных последовательностей (фрагментов) ДНК.
Этапы получения последовательностей нуклеотидов ДНК:
1. Получение образцов ДНК:
— выделение всей (геномной) ДНК из клеток (лимфоцитов, фи- бробластов, амниотических клеток, клеток хориона);
— рестрикция ДНК — получение отдельных фрагментов ДНК (использование рестриктаз, которые разрывают ДНК по строго определенным последовательностям нуклеотидов из 4-6 пар оснований — сайтах рестрикции). 2. Амплификация — накопление (умножение, клонирование) одинаковых фрагментов ДНК:
— использование классических трудоемких методов: создание рекомбинантных плазмид —> введение их в бактериальную клетку —> размножение клеток —> выделение заданных фрагментов ДНК;
— использование полимеразной цепной реакции: разделение двухцепочечной ДНК на одноцепочечную —> присоединение праймеров (затравка) к одноцепочечным молекулам ДНК (по принципу комплементарности) —> синтез многочисленных по- линуклеотидных цепей на одноцепочечных молекулах в границах присоединения праймеров. 3. Электрофорез фрагментов ДНК — разделение фрагментов по молекулярной массе и электрическому заряду на поверхности агарозного геля. Каждый фрагмент имеет определенные размеры и занимает в геле определенное место в виде дискретной полосы. 4. Идентификация конкретных фрагментов ДНК с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Фрагменты ДНК переносятся на специальные фильтры, где проводится их гибридизация с радиоактивными синтетическими зондами или клонированными фрагментами ДНК. Зонд выявляет необходимый фрагмент ДНК путем
связывания с комплементарными ему нуклеотидными последова-тельностями фрагмента.
Изменение положения и длины фрагмента по сравнению с контролем (зондом), исчезновение или появление нового фрагмента свидетельствует о перестройках последовательности нуклеотидов в исследуемом гене. Базируясь на технологии получения нуклеотидных последова-тельностей ДНК, можно выделить следующие методы молекулярной генетики.
1. Метод секвенирования — определение нуклеотидной после-довательности ДНК. Таким методом полностью определена последовательность нуклеотидов генов глобина, некоторых гормонов (инсулина, гормона роста, пролактина и др.).
2. Метод полимеразной цепной реакции (используется для уве-личения числа фрагментов ДНК).
3. Метод получения праймеров, соответствующих известным генам.
4. Метод гибридизации нуклеиновых кислот.
5. Метод клонирования ДНК.
6. Метод получения рекомбинантных молекул ДНК.
7. Метод получения белков с помощью рекомбинантных молекул ДНК.
8. Создание библиотеки генов — полного набора (коллекции) клонированных фрагментов ДНК, полученных в результате рестрикции тотальной ДНК. Методы молекулярной генетики позволяют:
• идентифицировать мутации в гене. Примером выявления мутантного гена является диагностика серповидно-клеточной анемии в эмбриональном периоде. Фрагменты ДНК, полученные при действии рестриктаз у здорового и больного, сравниваются с помощью метода гибридизации по Саузерну, при этом в качестве зонда используется радиоактивно меченая ДНК гена Р-глобина;
• диагностировать моногенное наследственное заболевание путем определения нуклеотидной последовательности генов (гемофилия, гемоглобинопатия) и выявления мутантных генов (фенилкетонурия, муковисцидоз);
• осуществлять генетический анализ полиморфизма ДНК родителей и детей;
• определять индивидуальную изменчивость ДНК человека по вариабельным точкам ДНК, молекулярный анализ которых по-зволяет проводить идентификацию личности человека);
• выделять и синтезировать гены (выделение, синтез и кло-нирование генов является одним из этапов генной инженерии):
а) выделение генов: получение определенных фрагментов ДНК с помощью рестриктаз: разделение фрагментов по молекулярной массе и электрическому заряду —» определение длины фрагмента —> выявление нуклеотидной последовательности данного гена;
б) синтез генов (варианты): химический синтез — синтез опре-деленных последовательностей нуклеотидов, соответствующих данному гену (используют генетический код и по известной последовательности аминокислот химическим путем синтезируют последовательность ДНК). Ферментативный синтез — с помощью фермента обратной транс - криптазы (ревертазы) на матрице мРНК синтезируют комплементарную ДНК.
